\documentclass[a4paper, finnish, 12pt]{tutthesis}   % paperityyppi, kieli, kirjasin korkeus, dokumentin laji, ym.

%------------------------------------------------------------------------------
% Paketit
%------------------------------------------------------------------------------

\usepackage[T1]{fontenc}                    % Tekstiasetuksia, T1-koodatut fontit
\usepackage[utf8]{inputenc}
\usepackage[finnish]{babel}                 % Suomenkielinen tavutus ja otsikot
\usepackage{pslatex}                        % makes the entire document to use ps fonts => pdf looks better
\usepackage{graphicx}
\usepackage{amsmath}                        % kaavojen lisäominaisuuksia
%\usepackage{enumerate}
%\usepackage{cite}
\usepackage{hyperref}                     % Tällä tulee hyper-linkitys nettiin ja sisällysluetteloon etc.
%\usepackage[margin=1cm]{caption}
\usepackage{caption}
\usepackage[margin=0.6cm]{subcaption}
\usepackage{float}
\usepackage{blindtext}
%\usepackage{standalone}
\usepackage{tikz}
\usepackage{pgfplots}
\usepackage{pgfplotstable}
\usepackage{import}
\usepackage[nottoc,numbib]{tocbibind}
\usetikzlibrary{pgfplots.groupplots}


% pgfplots relative paths
\makeatletter
\def\relativepath{\import@path}
\makeatother


% external tikz
\usetikzlibrary{external}
\tikzexternalize[prefix=tikz/] 
\tikzset{external/up to date check=md5}


% Function for drawing plots with errorbands
\usepgfplotslibrary{fillbetween}
% Takes seven arguments: data table name, x column, y column, error column,
% color, error bar opacity, line type.
% ---
% Creates invisible plots for the upper and lower boundaries of the error,
% and names them. Then uses fill between to fill between the named upper and
% lower error boundaries. All these plots are forgotten so that they are not
% included in the legend. Finally, plots the y column above the error band.
\newcommand{\errorband}[7]{
  \addplot [name path=pluserror,draw=none,no markers,forget plot]
    table [comment chars={@,\#}, x index=#2,y expr=\thisrowno{#3}+\thisrowno{#4}] {#1};

  \addplot [name path=minuserror,draw=none,no markers,forget plot]
    table [comment chars={@,\#}, x index=#2,y expr=\thisrowno{#3}-\thisrowno{#4}] {#1};

  \addplot [forget plot,fill=#5,opacity=#6]
    fill between[on layer={},of=pluserror and minuserror];

  \addplot [#5, no markers, #7] table[comment chars={@,\#}, x index=#2, y index=#3] {#1};
}


% global pgfplot settings
\pgfplotsset{
  /pgfplots/table/comment chars={@,\#}, % read XVG files with pgfplots
  /pgf/number format/use comma,
  /pgf/number format/1000 sep={},
  every axis plot post/.append style={mark=none, line width=1pt},
  legend cell align=left,
}

% Hyphenation
\usepackage{hyphenat}
\hyphenation{ze-ta-po-ten-ti-aa-li e-lek-tro-fo-reet-tis-ta GROMACS}




\pagenumbering{Roman}
\begin{document}

\thispagestyle{empty}

\vspace*{-.5cm}\noindent

\includegraphics[width=8cm]{tty-logo}

\vspace{6.8cm}

\noindent{\bf\large \textsf{HEIKKI MIKKOLAINEN}}\\
{\bf\large \textsf{HDL-HIUKKASTEN RAKENNE JA ZETA-POTENTIAALI}}\\
\textsf{Kandidaatintyö}

\vspace{8.7cm} % jos kaksi otsikkoriviä vaihda -> 6.7cm

\begin{flushright}
  
\begin{minipage}[c]{6.8cm}
\begin{spacing}{1.0}
\textsf{Tarkastaja: Ilpo Vattulainen}\\
\textsf{Jätetty tarkastettavaksi: 12.5.2016}\\
%\textsf{Tarkastaja ja aihe hyväksytty}\\ 
%\textsf{xxxxxxx tiedekuntaneuvoston}\\
%\textsf{kokouksessa xx.xx.xxxx}\\
\end{spacing}
\end{minipage}
\end{flushright}

\newpage

\setcounter{page}{1} % tämä tarvitaan, jottei ensimmäinen sivu kansilehden jälkeen olisi numero 2.

\chapter*{TIIVISTELMÄ}
\begin{spacing}{1.0}
\textsf{TAMPEREEN TEKNILLINEN YLIOPISTO}\\
\textsf{Teknis-luonnontieteellinen koulutusohjelma}\\
{\bf \textsf{Heikki Mikkolainen: HDL-hiukkasten rakenne ja zeta-potentiaali}}\\
\textsf{Kandidaatintyö, 23 sivua}\\
\textsf{Toukokuu 2016}\\
\textsf{Pääaine: Teknillinen fysiikka}\\
\textsf{Tarkastajat: Professori Ilpo Vattulainen}\\
\textsf{Avainsanat: HDL, zeta-potentiaali, molekyylidynamiikka, kolesteroli, ateroskleroosi. }\\
\end{spacing}

\noindent
``Hyvänä kolesterolina'' tunnetun HDL-hiukkasen (high density lipoprotein) ominaisuuksia tutkittiin laskennellisten molekyylidynamiikkasimulaatioiden avulla. Lipoproteiinit ovat rasva-aineista, eli lipideistä, ja proteiineista koostuvia hiukkasia, jotka kuljettavat kolesterolia ihmisen kehossa, ja ovat siten merkittäviä tekijöitä sydän- ja verisuonisairauksien synnyssä. HDL on lipoproteiineista tihein ja pienin. Se kuljettaa kolesterolia pois verisuonista, ja siten ehkäisee verisuonien tukkeutumista. Pienen koon takia HDL-hiukkasten kokeellinen tutkimus on haasteellista, ja esimerkiksi proteiinien rakennetta hiukkasen pinnalla ei täysin tunneta.

Eräs mielenkiintoinen  ominaisuus on hiukkasen zeta-potentiaali.
HDL-hiukkasen pinnalla olevat proteiinit ovat negatiivisesti varautuneita, joten HDL vaikuttaa sitä ympäröivien ionien jakaumaan. Se vetää vastaioneja puoleensa, jolloin niistä muodostuu sen pinnalle kerros, joka liikkuu hiukkasen mukana. Sähköstaattinen potentiaali tämän kerrostuman pinnalla voidaan kokeellisesti mitata, ja sitä kutsutaan zeta-potentaaliksi.

Aiempien tutkimusten ja kirjallisuudesta saadun tiedon perusteella HDL-hiukkasesta rakennettiin kaksi  hieman eri kokosta atomitason tietokonemallia. Malleja tutkittiin molekyylimallinnusohjelmalla, ja niiden tärkeimmät ominaisuudet määritettiin. Tuloksia verrattiin muihin tutkimuksiin, ja mallien todettiin vastaavan todellisuutta suureksi osin melko hyvin. Zeta-potentiaali määritettiin eräässä toisessa tutkimuksessa kehitettyä menetelmää käyttäen, mutta tulokset eivät vastanneet kirjallisuudessa esiintyviä arvoja. Eron syytä pyrittiin selvittämään tarkastelemalla  zeta-potentiaaliin vaikuttavia ilmiöitä, kuten polaaristen vesimolekyylien orientoitumista.



%\blindtext

%\newpage
%\chapter*{ABSTRACT}
%\begin{spacing}{1.0}
%\textsf{TAMPERE UNIVERSITY OF TECHNOLOGY}\\
%\textsf{Master's Degree Programme in xxxxxxx Technology}\\
%{\bf \textsf{AUTHOR : Title}}\\
%\textsf{Master of Science Thesis, xx pages, x Appendix pages}\\
%\textsf{xxxxxx 201x}\\
%\textsf{Major: }\\
%\textsf{Examiner: }\\
%\textsf{Keywords: }\\
%\end{spacing}

%\noindent 
%First paragraph

%\noindent
%Second paragraph

\newpage

\chapter*{ALKUSANAT}
%\blindtext

Allekirjoittanut kiittää ohjauksesta Ilpo Vattulaista sekä Topi Karilaista,
joka on periaatteessa toiminut tämän kandidaatintyön pohjana olevan projektin
ohjaajana. Kiitokset zeta-potentiaalin laskemiseen käytettävästä koodista ja
sen käytön opastuksesta kuuluvat Hector Martinez-Searalle. Kiitokset myös
entisille ja nykyisille Batcaven tyypeille ym. kollegoille avusta, vinkeistä ja
hyvästä seurasta. %Kiltahuoneen kahvijuopoille kiitokset kahvin keittämisestä.


\vspace{2cm}
\noindent
Hervannassa, 12.5.2016


\vspace{1,5cm}
\noindent
Heikki Mikkolainen


\newpage
\renewcommand\contentsname{Sisällys} % poista jos kieli muu kuin suomi
\tableofcontents
%\newpage
%\listoffigures
%\listoftables

%\newpage
%\chapter*{TERMIT JA NIIDEN MÄÄRITELMÄT}
%
%\begin{termiluettelo}
%\item [ApoA-I] Apolipoproteiini A-1
%\item [CETP] Cholesteryl ester transfer protein
%\item [CO] Cholesteryl oleate
%\item [DSSP] Dictionary of protein secondary structure
%\item [GROMACS] Groningen Machine for Chemical Simulations 
%\item [HDL] High density lipoprotein
%\item [LDL] Low density lipoprotein
%\item [MD] Molekyylidynamiikka
%\item [OPLS] Optimized Potentials for Liquid Simulations
%\item [PME] Particle mesh Ewald
%\item [POPC] 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
%\item [RDF] Radial distribution function
%\item [SASA] Solvent accessible surface area
%\item [SRB1] Scavenger receptor class B member 1
%\item [VLDL] Very low density lipoprotein
%\item [VMD] Visual molecular dynamics
%\end{termiluettelo} 


\newpage
\renewcommand{\chaptermark}[1]{\markboth{\thechapter. \ #1}{}}
\renewcommand{\sectionmark}[1]{\markright{}{}}
\lhead{\fancyplain{}{\leftmark}}

% Tästä alkaa varsinainen teksti
\pagenumbering{arabic}
\newpage



%%%%%%%%%%%%%%%%
%%% JOHDANTO %%%
%%%%%%%%%%%%%%%%
\chapter{Johdanto}
Lipoproteiinien on jo pitkään tiedetty olevan merkittävä tekijä sydän- ja verisuonitautien synnyssä. Lipoproteiineista tiheimmällä eli HDL:llä on huomattu olevan näiltä sairauksilta suojaava vaikutus. Tästä syystä HDL on saanut lempinimen ``hyvä kolesteroli''.
Vaikka lipoproteiineja on tutkittu jo vuosikausia, niiden rakenne ja toimintaperiaate on edelleen osittain epäselvä. Pieni koko ja monimutkainen koostumus lienevät suurimmat ongelmat etenkin HDL:n kokeellisessa tutkimuksessa.


Tässä kandidaatintyössä perehdytään HDL-hiukkasten ominaisuuksiin molekyylidynamiikkasimulaatioden avulla. Työssä on tehty HDL:sta atomistinen malli, jonka ominaisuuksia tutkitaan. Aiheesta on aiemmin tehty useita vastaavia tutkimuksia \cite{vuorela_role_2010}\cite{ollila2012interfacial}, mutta valtaosassa niistä on käytetty ns. karkeistettuja malleja. Kiekkomaisista HDL-hiukkasista on tehty myös atomistisia simulaatioita, mutta tässä työssä keskitytään nimenomaan pallomaisiin hiukkasiin.
Erityisesti tässä työssä tutkitaan proteiinien konformaatiota HDL:n pinnalla ja HDL:n sähköstaattisia ominaisuuksia.%Lisäksi tutkitaan vielä fullereenien vaikutusta HDL:n ominaisuuksiin.

Kahden hieman erikokoisen HDL-hiukkasen ominaisuuksia verrataan toisiinsa, sekä muiden laskennallisten ja kokeellisten tutkimusten tuloksiin. Hiukkasten zeta-potentiaali määritetään käyttäen Heikkilän ym. artikkelissa \cite{goldnanoparticle} esiteltyä menetelmää. Lopuksi tutkitaan kuinka esimerkiksi vesimolekyylien orientoituminen vaikuttaa zeta-potentiaaliin.

%%%%%%%%%%%
%%% HDL %%%
%%%%%%%%%%%
\chapter{HDL}
Ateroskleroosi eli valtimonrasvoittumistauti on edelleen eräs suurimmista kuoleman aiheuttajista länsimaissa. Merkittävimpiä riskitekijöitä ovat korkea verenpaine, diabetes, lihavuus, tupakointi ja veren korkea kolesterolipitoisuus \cite{Toth-2005-ID72}. Ateroskleroosissa valtimon sisäpinnalla olevan kalvon alle kerääntyy kolesterolia. Ajan myötä kolesterolikertymä, eli plakki, kasvaa niin suureksi, että se alkaa haitata veren virtausta. Plakki voi myös revetä, mikä aiheuttaa suonen tukkiutumisen.

Hyvin hydrofobisena molekyylinä kolesteroli ei sinällään liukene vereen, joten se kulkeutuu verisuonistossa lipoproteiineiksi kutsuttujen hiukkasten mukana \cite{vonEckardstein-2001-ID73}. Lipoproteiinit ovat lipideistä, eli rasva-aineista, ja proteiineista koostuvia kokonaisuuksia, jotka liukenevat veteen proteiinien polaarisuuden ansiosta. Lipoproteiinin rakenne on esitetty kuvassa \ref{fig:struct}. Hydrofobiset lipidit, kuten triglyseridit ja kolesteryylioleaatit, muodostavat lipoproteiinin ytimen. Hydrofobisen ytimen pinnalla on kerros amfipaattisista lipidejä, kuten fosfolipidejä, joissa hydrofiiliseen pääryhmään on liittynyt hydrofobisia hiiliketjuja. Lipideistä koostuvan rakkulan pinnalle on kiinnittynyt apolipoproteiineiksi kutsuttuja amfipaattisia proteiineja. Apolipoproteiinit jaetaan useampaan alaluokkaan, joista tärkeimmät ovat levymäinen apolipoproteiini B ja alfa-heliksinen apolipoproteiini A.

Lipoproteiinit voidaan jakaa tiheyden perusteella kolmeen luokkaan: HDL (high density lipoprotein), LDL (low density lipoprotein)  ja VLDL  (very low density lipoprotein). Apolipoproteiini A muodostaa HDL-hiukkasia ja apolipoproteiini B muodostaa LDL-hiukkasia. Useiden tutkimusten mukaan veren korkea HDL-pitoisuus madaltaa riskiä sairastua ateroskleroosiin, koska HDL kuljettaa kolesterolia verisuonistosta maksaan hävitettäväksi \cite{Toth-2005-ID72}. LDL tunnetaan yleisesti ``pahana kolesterolina'', sillä se edesauttaa ateroskleroosin syntymistä kuljettamalla kolesterolia valtimoihin.

HDL hiukkaset voidaan vielä tarkemmin erotella viiteen eri alaluokkaan. Nämä luokat ovat tiheimmästä alkaen lueteltuna HDL$_{\text{3c}}$, HDL$_{\text{3b}}$, HDL$_{\text{3a}}$, HDL$_{\text{2a}}$ ja HDL$_{\text{2b}}$. Tiheyden lisäksi eri alaluokkiin kuuluvat HDL-hiukkaset eroavat toisistaan lipidi- ja proteiinikoostumukseltaan. \cite{chapman1981density}\cite{goulinet1997plasma}

\begin{figure}[H]
  \centering
  \includegraphics[scale=0.34]{figures/Structure_of_a_Lipoprotein.png}
  \caption{Lipoproteiinin rakenne \cite{fig_struct}. }
  \label{fig:struct}
\end{figure}


\section{Käänteinen kolesterolin kuljetus}
Maksa tuottaa apoA-I -apolipoproteiinia, joka on HDL-hiukkasien tärkein proteiinikomponentti. ApoA-I vapautuu veriplasmaan jossa se muodostaa fosfolipidien kanssa nuoria HDL hiukkasia. Fosfolipidit pyrkivät amfipaattisen luonteensa takia muodostamaan kaksoiskalvon, jossa kalvojen hydrofobiset puolet ovat vastakkain. ApoA-I kietoutuu kaksoiskalvorakenteen ympärille, ja näin muodostuu kiekkomainen rakenne.  Nämä hiukkaset keräävät kolesterolia verisuonien seinämiin kerääntyneestä plakista.

LCAT-entsyymi (Lecithin—cholesterol acyltransferase) muuttaa kolesterolin kolesteryyliesteriksi. Kolesteryyliesterit ovat hyvin hydrofobisia molekyylejä, joten ne pyrkivät kaksoiskalvorakenteen sisään. Tällöin HDL-hiukkanen paisuu, ja  kiekkomainen rakenne muuttuu pallomaiseksi. HDL kuljettaa kolesteroliesterin maksaan, jossa se liittyy  SRB1-reseptoriin (scavenger receptor class B member 1) ja vapauttaa lastin. HDL voi myös siirtää kolesteryyliestereitä muihin lipoproteiineihin CETP-proteiinin (cholesteryl ester transfer protein) välityksellä. \cite{Ohashi-2005-ID75}

\section{Proteiinien konformaatio}
ApoA-I on 243 aminohapon pituinen varauksellinen apolipoproteiini, jossa varsinkin aminohapot 44-243 ovat sekundaarirakenteeltaan pääasiassa alfa-heliksiä \cite{Segrest-1999-ID79}.
Pallomaisessa HDL-hiukkasessa noin 76-80 prosenttia apoA-I -proteiinista on alfa-heliksiä \cite{huang_apolipoprotein_2011}. Heliksi on hyvin amfipaattinen, eli heliksin toisella puolella on enimmäkseen hydrofobisia aminohappoja, kun taas toinen puoli koostuu lähinnä polaarisista aminohapoista \cite{Silva-2008-ID78}. 
Kiekkomaiset HDL-hiukkaset koostuvat noin 160 lipidistä, ja useimmiten kahdesta apolipoproteiinista. Kahden proteiinin välisten sidosten perusteella proteiinit todennäköisesti muodostavat lipidien ympärille ``kaksoisvyön'' siten että että ne asettuvat vierekkäin vastakkaissuuntaisesti. \cite{Segrest-1999-ID79}

Pallomaisissa HDL-hiukkasissa on kolmesta viiteen apolipoproteiinia, mutta tutkimusten mukaan niiden väliset kontaktit ovat silti vastaavanlaisia kuin kiekkomaisen HDL:n kaksoisvyömallissa. Tämän voisi selittää rakenne, jossa toinen puoli kaksoisvyöstä purkautuu ja proteiinit erkanevat toisistaan. Siten proteiinit voivat muodostaa sidoksia muiden apolipoproteiinien kanssa. Näin muodostuu häkkimäinen rakenne, jossa kaikilla proteiineilla voi niiden lukumäärästä riippumatta olla samankaltaiset sidokset toisiin proteiineihin. \cite{Silva-2008-ID78} Mikäli apolipoproteiinit muodostaisivat tällaisen rakenteen täysin suoristettuina, olisi niiden muodostaman ``häkin'' arvioitu halkaisija suurempi kuin HDL-hiukkasen halkaisija. Häkin voidaan kuitenkin olettaa vääntyvän tai kiertyvän siten että sen koko täsmää HDL:n kokoon. \cite{huang_apolipoprotein_2011}

\section{Zeta-potentiaali}
Varaukselliset hiukkaset, kuten HDL, vaikuttavat ionien jakaumaan hiukkasen ympärillä. Vastaionien konsentraatio kasvaa pinnan läheisyydessä, ja ympäröivästä nesteestä muodostuu kaksoiskerros. Sisempi kerros on Stern-kerros, jossa ionit ovat sitoutuneet tiukasti kiinni hiukkaseen. Ulommassa kerroksessa ionit ovat sitoutuneet hiukkaseen löyhemmin ja voivat liikkua vapaammin, mutta kulkeutuvat kuitenkin hiukkasen mukana. Näiden kerrosten rajapintaa kutsutaan Stern-pinnaksi. Uloimman kerroksen ulkopintaa taas kutsutaan liukupinnaksi (engl. slipping plane), ja sähköstaattinen potentiaali tällä pinnalla on zeta-potentiaali. Zeta-potentiaalin suuruus kertoo hiukkasten taipumuksesta kerääntyä rykelmiksi. Jos zeta\hyp{}potentiaali on hyvin positiivinen (tai hyvin negatiivinen), hiukkaset hylkivät toisiaan, eikä rykelmiä muodostu. Yleisesti ottaen zeta-potentiaalin ollessa yli $+30$ mV tai alle $-30$ mV, voidaan seosta pitää stabiilina.

Kokeellisesti zeta-potentiaali voidaan määrittää esimerkiksi tutkimalla hiukkasten elektroforeettista liikkuvuutta. Kokeellisen menetelmin tehdyn tutkimuksen mukaan HDL:n zeta-potentiaali olisi $-12,4\pm0.1$ mV \cite{hdlzeta}.  Toisen lähteen mukaan HDL:n  pintapotentiaali (engl. surface potential), eli potentiaali hiukkasen todellisella pinnalla, olisi $-11,0$ mV (HDL$_2$) tai $-11,5$ mV (HDL$_3$) \cite{sparks1992quantitative}.

%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%%% MENETELMÄT %%%
%%%%%%%%%%%%%%%%%%
\chapter{Menetelmät}
Kaikki työssä tehty tutkimus on tehty laskennallisin menetelmin. Simulaatioiden laskemiseen sekä niiden analysointiin käytettiin GROMACS-ohjelmistoa. Käytössä oli ohjelmiston versio 4.6. Laskuja suoritettiin sekä Tieteen tietotekniikan keskuksen (CSC) että Tampereen teknillisen yliopiston omilla supertietokoneilla.
Simuloitujen systeemien visualisointiin käytettiin VMD-ohjelmaa \cite{HUMP96}.
Laskennallisesti raskaita analyysejä nopeutettiin rinnakkaistamalla ajoja GNU Parallel -ohjelmalla \cite{Tange2011a}. Tulosten käsittelyä varten kirjoitetuissa skripteissä hyödynnettiin NumPy-pakettia \cite{numpy}.


\section{Molekyylidynamiikka}
Molekyylidynamiikka (MD) on tietokonesimulaatiomenetelmä, jolla monimutkaisia systeemejä voidaan mallintaa atomitasolla. Molekyylidynamiikassa ratkaistaan numeerisesti Newtonin liikeyhtälöt kullekin systeemin atomille, jolloin voidaan seurata systeemin evoluutiota ajan kuluessa.

Klassisessa molekyylidynamiikassa atomien välisiä vuorovaikutuksia kuvaa potentiaalifunktio, joka on yleensä muotoa
\begin{align}
  \begin{split}
    U({\mathbf r_1},\cdots,{\mathbf r_N})
    &= \sum_{\text{sidokset}} \frac{a_i}{2} (l_i - l_{i0})^2 \\
    &+ \sum_{\text{kulmat}} \frac{b_i}{2} (\theta_i - \theta_{i0})^2 \\
    &+ \sum_{\text{torsio}} \frac{c_i}{2} [ 1 + \cos( n\omega_i - \gamma_i ) ] \\
    &+ \sum_{\text{atomiparit}} 4 \epsilon_{ij}\left[
      \left( \frac{\sigma{ij}}{r_{ij}} \right)^{12}
      \left( \frac{\sigma{ij}}{r_{ij}} \right)^{6} 
      \right] \\
    &+ \sum_{\text{atomiparit}} k \frac{q_iq_j}{r_{ij}}.
  \end{split}
%http://dasher.wustl.edu/chem478/reading/md-intro-1.pdf
\end{align}
Kolme ensimmäistä termiä ovat molekyylin sisäisiä vuorovaikutuksia. Atomien välisten kovalenttisten sidosten venymistä ja taipumista kuvataan siis harmonisina potentiaaleina. Neljäs termi kuvaa atomien välisiä repulsiivisia ja attraktiivisia dispersiovuorovaikutuksia Lennard-Jones -mallin mukaisesti. Viides termi kuvaa atomien välisiä sähkö\-staattisia vuorovaikutuksia.
\cite{allen2004introduction}
Potentiaalifunktiossa esiintyvät vakiot saadaan käytetystä voimakentästä, joita on kehitetty erilaisia. Tässä työssä on käytetty  OPLS (Optimized Potentials for Liquid Simulations) voimakenttää.

Potentiaalifunktiosta saadaan laskettua atomeihin vaikuttavat voimat systeemin tilan perusteella
\begin{align}
  {\mathbf  F_i} = - \nabla_{\mathbf r_i} U({\mathbf r_1},\cdots,{\mathbf r_N}).
\end{align}
Kun atomiin vaikuttavat voimat tunnetaan, voidaan laskea sen kiihtyvyys, mistä taas voidaan laskea sen nopeus. Kun nopeus tunnetaan, voidaan laskea, mikä on atomin sijainti lyhyen aika-askeleen $\delta t$ kuluttua
\begin{align}
  {\mathbf r_i}(t +\delta t) = {\mathbf r_i}(t) - {\mathbf v_i}(t) \delta t.
\end{align}
Aika-askeleen kuluttua atomien sijainnit ovat muuttuneet hieman, joten myös atomeihin vaikuttavat voimat ovat muuttuneet. Voimat lasketaan uudelleen, ja taas määritetään atomien sijainnit pienen aika-askeleen kuluttua. Tätä algoritmia toistamalla saadaan laskettua atomien liikeradat systeemissä.



\section{Analyysimenetelmät}
Simulaatioista saadun datan analysointia varten tulee GROMACS-ohjelmiston mukana useita valmiita analyysiohjelmia. Tärkein simulaatiosta tallennettava tieto on atomien koordinaatit simulaation aikana. Tämän tiedon perusteella voidaan jo päätellä tai laskea monia asioita, kuten esimerkiksi tutkittavien kappaleiden koko. 

\subsection{HDL:n koko ja rakenne}
HDL:n rakennetta voidaan tutkia radiaalisen jakauman (engl. radial distribution function, RDF) avulla.
Radiaalinen jakaumafunktio $g(r)$  kertoo suhteellisen todennäköisyyden löytää hiukkanen etäisyydellä $r$ määrätystä pisteestä, tässä tapauksessa HDL:n keskipisteestä. RDF määritellään seuraavasti:
\begin{align}
  g(r) = \frac  { \left <\rho(r) \right >}  {\left < \rho \right > _{lokaali}},
\end{align}
jossa $\left <\rho(r) \right >$ on hiukkasten tiheys etäisyydellä $r$ ja $\left < \rho \right > _{lokaali}$ on hiukkasten keskimääräinen tiheys kaikilla etäisyyksillä. \cite{gromacsman} RDF:n laskemiseen käytettiin GROMACS-paketin  g\_rdf-ohjelmaa, joka jakaa tutkittavan systeemin $dr$:n paksuisiin pallokuoriin ja laskee näiden hiukkastiheydet. Samalla tulee laskettua myös normalisoimaton radiaalinen tiheys etäisyyden $r$ funktiona. Laskemiseen käytetään tiheyksien keskiarvoa mahdollisimman pitkältä aikaväliltä.  


Gyraatiosäde on neliöllinen keskiarvo kappaleen osien etäisyyksistä massakeskipisteestä. Sitä käytetään usein proteiinien kompaktiuden mittana. GROMACS:n työkalu g\_gyrate laskee gyraatiosäteen $R_g$ seuraavasti:
\begin{align}
  R_g = \left ( 
  \frac{
    \sum_i ||{\mathbf r_i}|| ^2 m_i
  }
  {
    \sum_i m_i 
  }
  \right ) ^{1/2},
\end{align}
jossa $m_i$ on atomin $i$ massa ja ${\mathbf r_i}$ on atomin sijainti suhteessa koko molekyylin massakeskipisteeseen.
\cite{gromacsman}
Gyraatiosäteen avulla on helppo vertailla hiukkasia toisiinsa, mutta se ei ole erityisen hyvä suure kuvaamaan hiukkasen todellista kokoa, joten käytetään jotain järkevämpää tapaa arvioida hiukkasen koon arviointiin. Määritetään hiukkasen säde tutkimalla HDL:n atomien radiaalista tiheyttä suhteessa vesimolekyylien radiaaliseen tiheyteen systeemissä. Hiukkasen säde olkoon etäisyys, jota kauempana veden atomitiheys on suurempi kuin HDL:n atomitiheys.

\subsection{Fosfolipidikerroksen ominaisuudet}
Lipidien järjestysparametri (engl. order parameter) on lipidikalvon järjestyneisyyttä kuvaava suure, joka voidaan kokeellisesti määrittää NMR-mittausten avulla. Järjestysparametri lipidin hiiliketjun hiilelle on määritelty seuraavasti:
\begin{align}
  S_{\text{CD}} = \left < \frac{3\cos ^2 \Theta - 1 }{2}\right >,
\end{align}
missä $\Theta$ on hiili-vety -sidoksen ja lipidikalvon normaalin välinen kulma. \cite{Vermeer2007} Kulmasulut tarkoittavat tässä keskiarvoa ajan suhteen.
Simulaatioista järjestysparametri voidaan määrittää g\_order-ohjelmalla, joka pystyy huomioimaan myös lipidikalvon kaarevuuden.

Fosfolipikalvon paksuus voidaan määrittää fosfolipidin pääryhmän ja hiiliketjun pään välisenä etäisyytenä. Pääryhmän fosforiatomin keskimääräinen etäisyys HDL:n keskipisteestä määritetään g\_rdf-ohjelmalla lasketusta jakaumasta integroimalla. Vastaavasti määritetään fosfolipidin sn1-hiiliketjun viimeisen hiiliatomin keskimääräinen etäisyys. Näiden erotuksesta saadaan arvio fosfolipidikalvon paksuudesta.

Lipidipääryhmäkohtaisen pinta-alan (engl. area per lipid headgroup) määrittäminen HDL:n kaltaiselle kappaleelle on haasteellinen tehtävä. HDL:n pinta on hyvin rosoinen ja epäsymmetrinen, joten on hankala määrittää kappaleelle säde jonka mukaan pinta-ala lasketaan. Lisäksi pienen koon takia pienikin virhe voi muuttaa tulosta merkittävästi. Tässä työssä säteeksi $R$ valitaan fosfolipidien pääryhmän fosforiatomin keskimääräinen etäisyys HDL:n keskipisteestä. Osa kappaleen pinnasta proteiinien peitossa, mikä täytyy ottaa huomioon. Fosfolipidien osuus kappaleen pinnasta arvioidaan atomitiheyksien perusteella. Jos fosfolipidiatomien tiheys etäisyydellä $r$ HDL:n keskipisteestä on  $\rho_{\text{POPC}}(r)$  ja proteiiniatomien tiheys vastaavasti $\rho_{\text{Proteiini}}(r)$, voidaan lipidipääryhmäkohtainen pinta-ala $A$ laskea kaavalla
\begin{align}
  A = \frac{R^2}{N} \times \frac{\rho_{\text{POPC}(R)}}{\rho_{\text{Proteiini}(R)}},
  \label{eq:areaperlipid}
\end{align}
missä $N$ on lipidien määrä kalvossa.

SASA (Solvent accessible surface area), eli liuottimen saavutettavissa oleva pinta-ala, on kappaleen pinta-ala, joka on sitä ympäröivän liuottimen saavutettavissa. SASA määritetään vierittämällä pallon muotoista testikappaletta molekyylin van der Waals -pintaa pitkin. Reitti, jota pitkin pallon keskipiste kulkee, määrää SASA:n. \cite{JCC:JCC540160303} Laskemalla SASA kullekin hiukkasen komponentille, voidaan määrittää niiden osuus hiukkasen pinnasta. SASA:n laskemiseen käytettiin GROMACS-paketin g\_sas-ohjelmaa. Testikappaleen säteenä käytettiin ohjelman oletusarvoa, joka on 0,14 nm.


\subsection{Proteiinien konformaatio}

Proteiinien sekundaarirakenteen tutkimiseen käytettiin DSSP-algoritmia. DSSP tunnistaa atomien koordinaattien perusteella proteiinin selkärangan vetysidokset ja päättelee niiden perusteella proteiinin sekundaarirakenteen
\cite{dssp}\cite{dssp83}. Mahdollisia rakenteita ovat erilaiset kierteet eli heliksit ($3_{10}$-heliksi, $\alpha$-heliksi ja $\pi$-heliksi), levyt eli laskokset ($\beta$-laskos), käännökset ja mutkat. GROMACS:n työkalu do\_dssp mahdollistaa DSSP-algoritmin käytön GROMACS:n tiedostoformaattien kanssa, ja sekundaarirakenteen muutoksia voidaan tarkkailla simulaation aikana.

%\subsection{Alfa-heliksien orientaatio}
%ApoA-1-lipoproteiinien alfa-heliksien tutkimista varten kirjoitettiin VMD-ohjelmistolla \cite{HUMP96} käytettävä skripti, joka laskee alfa-heliksien ja lipidien väliset kontaktit. Aminohapon katsotaan olevan kontaktissa lipidiin, mikäli näiden lyhin etäisyys on alle $2,5 \; nm$. Vertailemalla hydrofobisten ja hydrofiilisten aminohappojen kontaktien määriä, voidaan päätellä osoittavatko heliksien hydrofobiset puolet kohti lipidiydintä.



\subsection{Sähköstaattinen potentiaali}

Sähköstaattinen potentiaali $\phi$ etäisyydellä $r$ lasketaan kaavalla
\begin{align}
 \phi(r) =  \int_0^r \mathbf E(r') dr',
\end{align}
missä $\mathbf E$ on sähkökenttä:
\begin{align}
  \mathbf E(r) = \frac{Q_r}{4\pi \epsilon_0 r^2}.
\end{align}
$Q_r$ on $r$-säteisen pallon sisälleen sulkema varaus ja $\epsilon_0$ on tyhjiön permittiivisyys. Simulaatiossa jokaisella atomilla on vakiona pysyvä varaus/osittaisvaraus, joten $Q_r$ saadaan laskettua suoraan summaamalla kaikkien säteen $r$ sisällä olevien atomien varaukset. Sähköstaattinen potentiaali sekä varaus $Q_r$ lasketaan g\_H\_potential-ohjelmalla, joka on kehitetty GROMACS:n mukana toimitettavan g\_potential-ohjelman pohjalta. Ero alkuperäiseen ohjelmaan on mahdollisuus laskea potentiaali radiaalisesti tutkittavan kappaleen ympärillä. Parhaaseen tulokseen näyttäisi pääsevän laskemalla potentiaalin 0,001 nm välein, joten tätä arvoa käytettiin laskuissa.
Zeta-potentiaalin laskemiseen tarvitaan myös liukupinnan sijainti, jonka määritys onnistuu ionien radiaalista jakaumaa tarkastelemalla.
Debye-Hückel -teorian (DH) mukaan vapaasti liikkuvien ionien jakauma hiukkasen ympärillä noudattaa kaavaa 
\begin{align}
  \frac{1}{r}Ae^{-Br} + C,
  \label{eq:debyehuckel}
\end{align}
missä $A$, $B$ ja $C$ ovat vakioita.
Kun DH-käyrä sovitetaan vastaionien radiaalisen jakaumaan, voidaan liukupinnan arvioida olevan käyrien erkanemiskohdassa, ja zeta-potentiaali on tällöin sähköstaattinen potentiaali tässä kohdassa.  \cite{goldnanoparticle}

Vesimolekyylien orientoitumista HDL:n ympärillä tutkittiin GROMACS:n g\_sorient-ohjelmalla. Ohjelma määrittää kullekin vesimolekyyleille happiatomista  vetyatomien keskipisteeseen osoittavan vektorin. Tämän vektorin ja HDL-hiukkasen normaalin välinen kulma $\theta$ lasketaan jokaiselle vesimolekyylille. Eri etäisyyksillä HDL:n keskipisteestä sijaitseville vesimolekyyleille lasketaan $\theta$-kulman keskiarvo.





%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%%% SYSTEEMIT JA SIMULAATIOT %%%
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
\chapter{Systeemit ja simulaatiot}
HDL:n malli päätettiin rakentaa kolesteryylioleaatista, POPC-fosfolipidistä ja apoA-I -apolipoproteiinista. 106 kolesteryylioleaatista (CO)  rakennettiin lipidirakkulan ydin, jonka pinnalle asetettiin 133 POPC-molekyyliä.
Neljä apolipoproteiinia laitettiin löyhästi rakkulan ympärille kuvan \ref{fig:alkurakenne} mukaisesti.
Lipidien rakenteet on esitetty kuvassa \ref{fig:lipidit}.
Tällä koostumuksella arvioitiin saatavan ominaisuuksiltaan todellista HDL-hiukkasta vastaava malli, joka kuitenkaan ei ole liian monimutkainen simuloinnin ja analysoinnin kannalta. HDL:n malli asetettiin simulaatiolaatikkoon, jonka sivun pituudeksi määritettiin 13,5 nanometriä, minkä ajateltiin olevan riittävän suuri jotta periodisten reunaehdot eivät aiheuttaisi ongelmia. Laatikkoon lisättiin natrium-ioneja neutraloimaan proteiinien negatiivinen varaus. Systeemiä simuloitiin 5 nanosekuntia tyhjiössä, jolloin proteiini asettui nopeasti lipidirakkulan pinnalle. Simulaatiolaatikkoon lisättiin sattumanvaraisiin sijainteihin vesimolekyylejä siten että laatikko täyttyi. Osa vesimolekyyleistä korvattiin Cl$^-$ ja Na$^+$ -ioneilla, jotta veden ionikonsentraatio saatiin vastaamaan veren suolakonsentraatiota, joka on noin 150 mmol/l.
\vspace{1cm}
\begin{figure}[H]
  \centering
  \begin{subfigure}[c]{0.49\textwidth}
    \centering
    \includegraphics[scale=0.30]{figures/hdl_start.png}
  \end{subfigure}
  \begin{subfigure}[c]{0.49\textwidth}
    \centering
    \includegraphics[scale=0.30]{figures/hdl_1600ns.png}
  \end{subfigure}
  \caption{Ison HDL:n rakenne simulaation alussa ja lopussa. Vasemmanpuoleisessa kuvassa proteiinit (violetti) ovat aseteltuna lipidirakkulan ympärille. Fosfolipidit (vihreä) peittävät lähes koko lipidirakkulan, mutta myös kolesteryylioleaattia (oranssi) on joissain kohdissa hieman näkyvissä. Oikeanpuoleisessa kuvassa nähdään simulaation lopputulos. Proteiinit ovat asettuneet kiinni lipidirakkulan pintaan, ja alfa-heliksit ovat osittain purkautuneet. Graafinen esitys systeemistä tehtiin VMD-ohjelmistolla \cite{HUMP96}.}
  \label{fig:alkurakenne}
\end{figure}

Rakennetta tasapainotettiin ensin vakiotiolavuudessa (NVT) 100 pikosekuntia ja sitten vakiopaineessa (NPT) toiset 100 pikosekuntia. Tämän jälkeen aloitettiin 500 nanosekuntia pitkä tuotantosimulaatio. Tässä vaiheessa huomattiin sähköstaattisen potentiaalin laskeminen vaativan suuremman simulaatiolaatikon, joten systeemiin lisättiin vesimolekyylejä ja ioneja siten että laatikon kooksi saatiin 18 nanometriä. Simulaatiota jatkettiin suuremmassa laatikossa vielä 200 nanosekuntia. Koska tähän saakka tehdyillä simulaatioilla ei saavutettu sähköstaattisen profiilin osalta haluttuja tuloksia, päivitettiin lipidien voimakenttäparametrit uudempaan versioon. Simulaatiota jatkettiin simulaatioita päivitetyllä voimakentällä 1600 nanosekuntia.

\begin{figure}[t]
	%\includegraphics[scale=0.33]{figures/lipids.png}
	\includegraphics[width=\textwidth]{figures/lipids.png}
  %\centering
  %\begin{subfigure}[c]{0.24\textwidth}
    %\centering
    %\includegraphics[scale=0.33]{figures/CO_singlecolor.png}
  %\end{subfigure}
  %\begin{subfigure}[c]{0.24\textwidth}
    %\centering
    %\includegraphics[scale=0.33]{figures/CO_chemicalbook.png}
  %\end{subfigure}
  %\begin{subfigure}[c]{0.24\textwidth}
    %\centering
    %\includegraphics[scale=0.33]{figures/POPC_singlecolor.png}
  %\end{subfigure}
	\caption{Simulaatioissa käytetyt lipidit: kolesteryylioleaatti (CO) ja 1-palmitoyyli-2-oleoyyli-sn-glysero-3-fosfokoliini (POPC). Kolesteryylioleaatin neljästä hiilirenkaasta koostuvan rungon molemmissa päissä on hiiliketjut, joten molekyyli on hyvin hydrofobinen. POPC koostuu hydrofiilisesta pääryhmästä ja kahdesta pitkästä hydrofobisesta hiiliketjusta. Rakennekaavat: \cite{fig_co} ja \cite{fig_popc}.}
  \label{fig:lipidit}
\end{figure}


Vertailun vuoksi rakennettiin toinen pienempi systeemi poistamalla 20 kolesteryylioleaattia hiukkasen ytimestä. Resurssien säästämiseksi rakenteen pohjana käytettiin alkuperäistä isompaa systeemiä, jota oli jo simuloitu päivitetyllä voimakentällä muutamia kymmeniä nanosekunteja. Tätäkin systeemiä simuloitiin noin 1600 nanosekuntia. Systeemeistä käytetään nimiä ``iso HDL'' ja ``pieni HDL''.







\section{Voimakenttä, algoritmit ja parametrit}
Simulaatioissa käytettiin OPLS-voimakenttää (Optimized Potentials for Liquid Simulations). Integraattorina käytettiin leap-frog  -algoritmia \cite{van1988leap}. Käytetyn aika-askeleen pituus oli 2 femtosekuntia ja systeemien koordinaatit tallennettiin sadan pikosekunnin välein. Systeemin keskimääräinen lämpötila pyrittiin pitämään 310 kelvinissä käytettäen Nóse-Hoover -termostaattialgoritmia\cite{nose1984unified}\cite{hoover1985canonical}. Paine pidettiin keskimäärin yhdessä baarissa Parrinello-Rahman -barostaattialgoritmilla \cite{parrinello1981polymorphic}. Pitkän kantaman vuorovaikutuksien laskemiseen käytettiin  Particle mesh Ewald (PME) -menetelmää \cite{darden1993particle}\cite{essmann1995smooth}. Atomien sidosten pituudet rajoitettiin LINCS-algoritmillä \cite{hess1997lincs}\cite{hess2008p}. Simulaatioissa käytettiin periodisia reunaehtoja (engl. periodic boundary conditions).

Termostaattialgoritmia käytettiin säätämään koko systeemin keskimääräistä lämpötilaa sen sijaan että olisi jaettu systeemi pienempiin osiin. Tästä seurasi kineettisen energian epätasainen jakautuminen systeemissä. Vaikka lämpötila pysyikin HDL-hiukkasta ympäröivän veden osalta halutussa arvossa, itse HDL:n lämpötila laski simulaation aikana jonkin verran. Tältä ongelmalta olisi vältytty määrittämällä lämpötila erikseen HDL-hiukkaselle ja liuottimelle.
Koska lämpötilan muutos on kuitenkin melko pieni, voidaan olettaa ettei se merkittävästi vaikuta tässä työsttä esiteltyihin tuloksiin.


%%%%%%%%%%%%%%%%
%%% TULOKSET %%%
%%%%%%%%%%%%%%%%
\chapter{Tulokset}
Esimerkiksi HDL-hiukkasen ytimen gyraatiosäde näyttäisi saavuttavan lopullisen arvonsa noin 500 ns simuloinnin jälkeen kummankin tutkitun systeemin tapauksessa. Myös muut tutkitut ominaisuudet näyttäisivät konvergoituvan viimeistään tässä kohtaa simulaatiota, joten systeemien voidaan olettaa saavuttaneen tasapainon. Termostaattialgoritmin ongelmista johtuva lämpötilan aleneminen saattoi hidastaa systeemin tasapainottumista. Kaikkiin analyyseihin käytettiin 500 ns simuloinnin jälkeen kerättyä dataa, ja simulaation alkuosa hylättiin. 

\section{HDL:n koko ja rakenne}

HDL:n komponenttien radiaalinen tiheys on esitetty kuvassa \ref{fig:rdf}. Kolesteryylioleaatti muodostaa hydrofobisen ytimen, jonka ympärillä on POPC-kerros. Näiden jakaumat ovat kuitenkin merkittävästi päällekkäin, joten kerrosten ero on häilyvä, kuten aiemmissakin tutkimuksissa on todettu \cite{vuorela_role_2010}. Proteiinit ovat asettuneet lipidirakkulan pinnalle fosfolipidien pääryhmien lomaan. Fosfolipidien pääryhmät sijaitsevat keskimäärin 4.4 nm (iso HDL) tai 4.3 nm (pieni HDL) etäisyydellä hiukkasen massakeskipisteestä.

\begin{figure}[t]
  \begin{subfigure}[t]{0.49\textwidth}
  \centering
  \tikzsetnextfilename{rdf}
  \begin{tikzpicture}
    \begin{axis}[
	  width=7.2cm,
	  height=6.0cm,
	xmin=0, xmax=8.5,
	ymin=0, ymax=115,
	ytick={0,20,40,...,140},
	minor x tick num=1,
	xlabel={Etäisyys $r$ [nm]},
	 xlabel style={xshift=3.5cm}, %shifting the y line text
	ylabel={Tiheys [1/nm$^3$]},
	legend style={at={(0.95, 0.60)},anchor=north east},
	%legend style={at={(0.00, 1.05)},anchor=south west},
	%legend columns=2, 
      ]
      \errorband{xvg/big/radialdensity/CO_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{orange}{0.4}{solid};
      \errorband{xvg/big/radialdensity/POPC_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{green}{0.4}{solid};
      \errorband{xvg/big/radialdensity/Protein_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{purple}{0.4}{solid};
      \errorband{xvg/big/radialdensity/Water_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{cyan}{0.4}{solid};
      \errorband{xvg/small/radialdensity/CO_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{orange}{0.4}{dashed};
      \errorband{xvg/small/radialdensity/POPC_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{green}{0.4}{dashed};
      \errorband{xvg/small/radialdensity/Protein_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{purple}{0.4}{dashed};
      \errorband{xvg/small/radialdensity/Water_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{cyan}{0.4}{dashed};
      \addlegendentry{\footnotesize CO}
      \addlegendentry{\footnotesize POPC}
      \addlegendentry{\footnotesize Proteiini}
      \addlegendentry{\footnotesize Vesi}
    \end{axis}
  \end{tikzpicture}
  \caption{Systeemin eri komponentit.}
  \label{fig:rdf}
  \end{subfigure}
  \begin{subfigure}[t]{0.49\textwidth}
  \centering
  \tikzsetnextfilename{rdf_AA}
  \begin{tikzpicture}
    \begin{axis}[
	  width=7.2cm,
	  height=6.0cm,
	xmin=2, xmax=7.5,
	ymin=0, ymax=38,
	minor x tick num=1,
	%xlabel={Etäisyys $r$ [nm]},
	xlabel={\vphantom{Etäisyys $r$ [nm]}},
	%ylabel={Tiheys [1/nm$^3$]},
	legend pos=north east,
	%legend style={at={(0.95, 0.60)},anchor=north east},
	%legend style={at={(0.00, 1.05)},anchor=south west},
	%legend columns=2, 
      ]
      \errorband{xvg/big/radialdensity/Hydrophobic_AA_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{magenta}{0.4}{solid};
      \errorband{xvg/big/radialdensity/Hydrophile_AA_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{olive}{0.4}{solid};
      \errorband{xvg/small/radialdensity/Hydrophobic_AA_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{magenta}{0.4}{dashed};
      \errorband{xvg/small/radialdensity/Hydrophile_AA_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{olive}{0.4}{dashed};
      \addlegendentry{\footnotesize Hydrofobinen}
      \addlegendentry{\footnotesize Hydrofiilinen}
    \end{axis}
  \end{tikzpicture}
  \caption{Proteiinien hydrofobiset ja hydrofiiliset aminohapot.}
  \label{fig:rdf_aa}
  \end{subfigure}
  \caption{Radiaalinen  atomitiheys etäisyydellä $r$ HDL:n massakeskipisteestä. Yhtenäiset viivat kuvaavat isoa systeemiä ja katkoviivat kuvaavat pientä systeemiä.}
\end{figure}

Atomitiheyksien perusteella laskettu HDL:n koko on esitetty taulukossa \ref{tbl:koko}. Myös pelkän lipidirakkulan sekä hydrofobisen ytimen koot laskettiin samaan tapaan, ja nämäkin arvot on esitetty samassa taulukossa. Lisäksi laskettiin HDL:n gyraatiosäde, joka oli isossa systeemissä $3,83\pm0,02$ nm sekä pienessä systeemissä $3,76\pm0,03$ nm. Koon perusteella tutkitut HDL-hiukkaset sopisivat HDL:n alaluokista parhaiten luokkaan 3C tai 3B, jos verrataan Huangin artikkelissa \cite{huang_apolipoprotein_2011} esitettyihin tuloksiin. 
\begin{table}[h]
  \centering
  \caption{HDL-hiukkasen koko ja fosfolipidikerroksen ominaisuudet. Säde laskettiin atomien tiheysjakaumien perusteella. Fosfolipidikalvon paksuus laskettiin pääryhmän ja sn1-hiiliketjun pään etäisyyksien (HDL:n keskipisteestä) erotuksena. Pinta-ala per lipidipääryhmä laskettiin kaavalla \ref{eq:areaperlipid}.}
  \label{tbl:koko}
  \begin{tabular}{l|c|c}
					& Iso HDL 		& Pieni HDL     \\ \hline
    Ytimen säde [nm] 				& 2,96$\pm$0,03		& 2,69$\pm$0,03 \\
    Lipidirakkulan säde [nm]    		& 3,90$\pm$0,02		& 3,81$\pm$0,02 \\
    Koko hiukkasen säde  [nm]         		& 4,48$\pm$0,02		& 4,43$\pm$0,02 \\
    Pääryhmän sijainti [nm]			& 4,44$\pm$0,02		& 4,32$\pm$0,02 \\
    Kalvon paksuus [nm]				& 1,42$\pm$0,03		& 1,47$\pm$0,04 \\
    Pinta-ala per lipidipääryhmä [nm$^2$]	& 0,75$\pm$0,02		& 0,64$\pm$0,02 \\
    %Pinta-ala per lipidi [nm$^2$] 	& 1.31$\pm$0.02		& 1.26$\pm$0.02 \\
  \end{tabular}
\end{table}

Fosfolipidien järjestyneisyys on esitetty kuvassa \ref{fig:order}. Kaksoiskalvoon \cite{seelig1978molecular} verrattuna ainakin POPC:n sn1-ketju on HDL-hiukkasessa jonkin verran epäjärjestyneempi. Sama trendi on havaittu myös muissa laskennallisissa tutkimuksissa \cite{catte2006novel}. Kokeellisesti mitattuja järjestysparametreja HDL:n kaltaisten hiukkasten fosfolipideille on hankalampi löytää. Pienessä systeemissä POPC on hieman järjestyneempi kuin isossa systeemissä. Syynä lienee lipidien tiukempi pakkautuminen.

Ison ja pienen systeemin fosfolipidikalvojen paksuudeksi mitattiin $1,42\pm0,03$ nm ja $1,47\pm0,04$ nm. Vesi-triglyseridi -rajapinnassa sijaitsevan POPC-kalvon paksuudeksi on eräässä laskennallisessa tutkimuksessa määritetty $1,75\pm0,11$ nm \cite{hennere2009molecular}. HDL:n fosfolipidikalvon voisi olettaa olevan ohuempi, koska lipidit ovat epäjärjestyneempiä. Pinta-ala per lipidipääryhmä oli isossa HDL-hiukkasessa $0,75\pm0,02$ nm$^2$ ja pienessä HDL-hiukkasessa $0,64\pm0,02$ nm$^2$, joka on erittäin lähellä  Huangin artikkelissa \cite{huang_apolipoprotein_2011} ilmoitettua arvoa 0,65 nm$^2$.

%\begin{figure}[H]
%  \centering
%  \tikzsetnextfilename{gyrate}
%  \begin{tikzpicture}
%    \begin{axis}[
%	xmin=0, xmax=1600,
%	xtick={0,500,...,2000},
%	minor x tick num=1,
%	minor y tick num=1,
%	ymin=2.375, ymax=2.6,
%	xlabel={Aika [ns]},
%	ylabel={Gyraatiosäde [nm]},
%	%legend style={at={(0.05, 0.60)},anchor=north west},
%	legend pos=north east,
%      ]
%      \addplot[blue] table [x index=0,y index=1] {xvg/big/gyrate/CO_10-mean_ns.xvg};
%      \addplot[red] table [x index=0,y index=1] {xvg/small/gyrate/CO_10-mean_ns.xvg};
%      \addlegendentry{Iso HDL}
%      \addlegendentry{Pieni HDL}
%    \end{axis}
%  \end{tikzpicture}
%  \caption{HDL:n hydrofobisen ytimen gyraatiosäde ajan funktiona.}
%  \label{fig:gyrate}
%\end{figure}
\begin{figure}[t]
  \begin{subfigure}[t]{0.47\textwidth}
    \centering
    \tikzsetnextfilename{order_sn1}
    \begin{tikzpicture}
      \begin{axis}[
	  %trim axis left,
	  width=7.2cm,
	  %width=6cm,
	  height=6.4cm,
	  xmin=1, xmax=16,
	  ymin=0, ymax=0.15,
	  minor x tick num=4,
	  minor y tick num=4,
	  y tick label style={/pgf/number format/fixed, /pgf/number format/precision=2},
	  xlabel={atomi},
	  xlabel style={xshift=3.4cm}, %shifting the y line text
	  ylabel={S$_{\text{CD}}$},
	  legend pos=north east,
	  %legend pos=south west,
	  %legend style={at={(0.95, 0.60)},anchor=north east},
	  /pgfplots/no markers,
	  /pgfplots/table/x index=0,
	  /pgfplots/table/y index=1,
	  /pgfplots/table/y error minus index=2,
	  /pgfplots/table/y error plus index=2,
	  /pgfplots/error bars/y dir=both,
	  /pgfplots/error bars/y explicit,
	  /pgfplots/error bars/error bar style={line width=0.5pt},
	]
	\addplot [blue] table[] {xvg/big/order/order_POPC_SN1_fixed_500001-1600000.xvg};
	\addplot [red] table[] {xvg/small/order/order_POPC_SN1_fixed_500001-1600000.xvg};
	\addlegendentry{Iso HDL}
	\addlegendentry{Pieni HDL}
      \end{axis}
    \end{tikzpicture}
    \caption{Sn1-hiiliketju.}
  \end{subfigure}
  \begin{subfigure}[t]{0.47\textwidth}
    \centering
    \tikzsetnextfilename{order_sn2}
    \begin{tikzpicture}
      \begin{axis}[
	  width=7.2cm,
	  %width=6cm,
	  height=6.4cm,
	  xmin=1, xmax=18,
	  ymin=0, ymax=0.15,
	  minor x tick num=4,
	  minor y tick num=4,
	  y tick label style={/pgf/number format/fixed, /pgf/number format/precision=2},
	  %xlabel={atomi},
	  xlabel={\vphantom{atomi}},
	  %xlabel={},
	  %ylabel={S$_{\text{CD}}$},
	  %legend style={at={(0.95, 0.60)},anchor=north east},
	  legend pos=north east,
	  /pgfplots/no markers,
	  /pgfplots/table/x index=0,
	  /pgfplots/table/y index=1,
	  /pgfplots/table/y error minus index=2,
	  /pgfplots/table/y error plus index=2,
	  /pgfplots/error bars/y dir=both,
	  /pgfplots/error bars/y explicit,
	  /pgfplots/error bars/error bar style={line width=0.5pt},
	]
	\addplot [blue] table[] {xvg/big/order/order_POPC_SN2_fixed_500001-1600000.xvg};
	\addplot [red] table[] {xvg/small/order/order_POPC_SN2_fixed_500001-1600000.xvg};
	\addlegendentry{Iso HDL}
	\addlegendentry{Pieni HDL}
      \end{axis}
    \end{tikzpicture}
    \caption{Sn2-hiiliketju.}
  \end{subfigure}
  \caption{Fosfolipidien hiiliketjujen järjestysparametrit.}
  \label{fig:order}
\end{figure}


SASA-laskujen tulokset on esitetty taulukossa \ref{tbl:sasa}. Proteiini peittää HDL:n pinnasta alle puolet, mikä on merkittävästi vähemmän kuin kokeellisissa tutkimuksissa. Huangin artikkelin \cite{huang_apolipoprotein_2011} mukaan tämän kokoisissa hiukkasissa proteiini peittäisi yli 70 \% hiukkasen pinnasta. 
\begin{table}[H]
  \centering
  \caption{Liuottimen (veden) saavutettavissa oleva pinta-ala (SASA). Taulukossa on esitetty absoluuttinen arvo nanometreinä koko hiukkaselle, sekä eritelty eri komponenttien prosentuaalinen osuus.}
  \label{tbl:sasa}
  \begin{tabular}{l|c|c|c|c}
			& HDL [nm$^2$]	& Proteiini [\%] & POPC [\%]	& CO [\%] \\ \hline
    Iso HDL		& 949$\pm$7	& 46$\pm$1	& 47$\pm$1	& 7$\pm$1 \\
    Pieni HDL		& 920$\pm$2	& 47$\pm$1	& 46$\pm$1	& 7$\pm$1 \\
  \end{tabular}
\end{table}






	
	
\section{Proteiinien konformaatio}
DSSP-analyysin perusteella vain $33\pm2$ prosenttia ison HDL:n ja $31\pm1$ prosenttia pienen HDL:n proteiinien sekundaarirakenteesta on alfa-heliksiä. Tämä on huomattavasti vähemmän kuin kokeellisissa tutkimuksissa on havaittu. Simulaation alkurakenteessa noin 91 prosenttia sekundaarirakenteesta oli alfa-heliksiä. Heliksi purkautui varsinkin ensimmäisessä tyhjiössä tapahtuneessa tasapainotussimulaatiossa rajusti, mikä selittää alhaisen lukeman. Parempia tuloksia voitaisiin saada maltillisemmalla systeemin tasapainotuksella, käyttäen keinotekoisia rajoitteita estämään sekundaarirakenteen purkautumista. Systeemiä voisi myös ensiksi simuloida karkeistetulla voimakentällä, kunnes proteiini saadaan asettumaan paikoilleen, ja tämän jälkeen muuntaa karkeistettu systeemi atomistiseksi. Näin onkin myöhemmissä tutkimuksissa tehty hyvin tuloksin. 

Visuaalisen tarkastelun perusteella näyttäisi, että proteiinit eivät niinkään ole kiertyneet lipidirakkulan ympärille, kuten Huang ym. esittävät artikkelissaan \cite{huang_apolipoprotein_2011}, vaan pikemminkin proteiiniketjuista koostuvat lenkit ovat romahtaneet satunnaisesti lipidirakkulan pinnalle. Sekundaarirakenteen purkautumisen ansiosta proteiinit voivat pakkautua pienempään tilaan kääntymällä mutkalle. Alfaheliksi on melko jäykkä rakenne, joten ilman sekundaarirakenteen purkautumista tilanne olisi varmastikin erilainen.  Sekundaarirakenteen purkautumisesta huolimatta apoA-I -molekyylien väliset sidokset näyttäisivät visuaalisen tarkastelun perusteella säilyvän simulaation aikana ainakin osittain. Pienellä ja isolla systeemillä ei ole merkittävää eroa proteiinin konformaation suhteen, koska pienen systeemin alkurakenteen valmistamiseen käytettiin ison systeemin simulaatiosta otettua rakennetta, jossa proteiinit olivat jo asettuneet lipidirakkulan pintaan.

Kuvassa \ref{fig:rdf_aa} on esitetty  proteiinien hydrofobisten ja hydrofiilisten aminohappojen tiheys eri etäisyyksillä HDL-hiukkasen keskipisteestä. Hydrofobisiksi aminohapoiksi laskettiin ne aminohapot, jotka ovat Wimley-White rajapintahydrofobisuusasteikon (engl. interface hydrophobicity scale) \cite{wimley1996experimentally} mukaan hydrofobisia. Hydrofobiset aminohapot sijaitsevat selvästi hieman lähempänä lähempänä HDL:n keskipistettä. Tämä viittaa siihen, että amfipaattiset alfa-heliksit kääntyvät sellaiseen asentoon, jossa hydrofobiset osat osoittavat kohti lipidejä, kuten Vuorela ym. mainitsevat artikkelissaan \cite{vuorela_role_2010}. 
%Hydrofobisista aminohapoista keskimäärin $27.3 \pm 0.8 $ prosenttia ja hydrofiilisista aminohapoista $23.2 \pm 1.2$ prosenttia olivat kosketuksissa lipiden kanssa. 


%\begin{figure}[H]
%  \centering
%  \tikzsetnextfilename{rdf_AA}
%  \begin{tikzpicture}
%    \begin{axis}[
%	xmin=2, xmax=7,
%	ymin=0, ymax=40,
%	minor x tick num=1,
%	xlabel={Etäisyys $r$ [nm]},
%	ylabel={Tiheys [1/nm$^3$]},
%	%legend style={at={(0.95, 0.60)},anchor=north east},
%      ]
%      \errorband{xvg/big/radialdensity/Hydrophobic_AA_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{red}{0.4}{solid};
%      \errorband{xvg/big/radialdensity/Hydrophile_AA_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{blue}{0.4}{solid};
%      \errorband{xvg/small/radialdensity/Hydrophobic_AA_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{red}{0.4}{dashed};
%      \errorband{xvg/small/radialdensity/Hydrophile_AA_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{blue}{0.4}{dashed};
%      \addlegendentry{Hydrofobinen}
%      \addlegendentry{Hydrofiilinen}
%    \end{axis}
%  \end{tikzpicture}
%  \caption{Hydrofobisten ja hydrofiilisten aminohappojen atomitiheys etäisyydellä $r$ HDL:n massakeskipisteestä. Yhtenäiset viivat kuvaavat isoa HDL:ää ja katkoviivat kuvaavat pientä HDL:ää.}
%  \label{fig:rdf_aa}
%\end{figure}


\section{Sähköstaattinen potentiaali}
 Kuvassa \ref{fig:debyehuckel} on esitetty ison HDL:n liukupinnan määritys natrium-ionien radiaalisesta tiheysfunktiosta.  Ionien tiheysjakauma ei ole läheskään yhtä tasainen kuin Heikkilän artikkelin \cite{goldnanoparticle} kultananopartikkelin tapauksessa, koska systeemin varaus on pienempi, mutta koko paljon suurempi, jolloin varaustiheys jää paljon alhaisemmaksi. Myös HDL:n epäsymmetrisyydellä on oma vaikutuksensa.
Liukupintaa ei siis voida määrittää kovin luotettavasti, mutta jonkinlainen suuntaa antava arvio voidaan tehdä.
Tiheysfunktioon sovitettu Debye-Hückel -käyrä (kaava \ref{eq:debyehuckel}) kuvaa tiheysfunktiota melko hyvin suurilla $r$:n arvoilla, mutta ei enää pienemmillä arvoilla kuin 6,5 nanometriä. Tällä perusteella liukupinnan säteeksi voidaan määrittää $r = 6,5$ nm, mikä on merkitty kuvaan katkoviivalla. Vastaavasti pienemmälle systeemille saadaan liukupinnan säteeksi 6,4 nanometriä (kuvaajaa ei ole esitetty).
\begin{figure}[t]
  \begin{subfigure}[t]{0.49\textwidth}
    \centering
    \tikzsetnextfilename{potentiaali}
    \begin{tikzpicture}
      \begin{axis}[
	  width=7.3cm,
	  height=6.9cm,
	  xmin=5.5, xmax=10,
	  ymin=-2.7, ymax=2.7,
	  ytick={-4,-3,...,4},
	  minor x tick num=1,
	  minor y tick num=4,
	  xlabel={Etäisyys $r$ [nm]},
	  ylabel={Potentiaali [mV]},
	  %legend style={at={(0.95, 0.60)},anchor=north east},
	  restrict x to domain={5:11}
	]
	\errorband{xvg/big/potential/Potential_500001-1600000_100-mean.xvg}{0}{1}{2}{blue}{0.4}{solid};
	\errorband{xvg/small/potential/Potential_500001-1600000_100-mean.xvg}{0}{1}{2}{red}{0.4}{solid};
	\addplot [gray, dashed] coordinates {(6.5,-3) (6.5,3)};
	\addlegendentry{Iso HDL}
	\addlegendentry{Pieni HDL}
      \end{axis}
    \end{tikzpicture}
    \caption{Sähköstaattinen potentiaali etäisyydellä $r$ HDL:n massakeskipisteestä.}
    \label{fig:potentiaali}
  \end{subfigure}
  \begin{subfigure}[t]{0.49\textwidth}
    \centering
    \tikzsetnextfilename{debyehuckel}
    \begin{tikzpicture}
      \begin{axis}[
	  width=7.3cm,
	  height=6.9cm,
	  xmin=5.5, xmax=9,
	  ymin=1.035, ymax=1.145,
	  ytick={1.02,1.04,...,2},
	  minor x tick num=1,
	  minor y tick num=1,
	  %ytick={0.13,0.135,0.14,...,0.15},
	  xlabel={Etäisyys $r$ [nm]},
	  ylabel={$g(r)$},
	  %legend style={at={(0.95, 0.60)},anchor=north east},
	  restrict x to domain={2:10},
	  y tick label style={/pgf/number format/fixed, /pgf/number format/precision=3},
	]
	\addplot [black] table [x index=0, y index=1] {xvg/big/slippingplane/rdf_NA.xvg};
	\addplot [red] table [x index=0, y index=1] {xvg/big/slippingplane/debyehuckel_rdf.xvg};
	\addplot [gray, dashed] coordinates {(6.5,0) (6.5,2)};
	\addlegendentry{tiheys}
	\addlegendentry{DH}
      \end{axis}
    \end{tikzpicture}
    \caption{Debye-Hückel -käyrä (DH) sovitettuna natrium-ionien radiaaliseen tiheysfunktioon.}
    \label{fig:debyehuckel}
  \end{subfigure}
  \caption{Zeta-potentiaalin määritys sähköstaattiesesta potentiaalista. Ison HDL:n arvioitu liukupinnan sijainti 6,5 nm on merkitty kuviin harmaalla katkoviivalla.}
  \label{fig:zeta}
\end{figure}

Ison ja pienen HDL:n sähköstaattiset potentiaalit on esitetty kuvassa \ref{fig:potentiaali}. Kuvasta nähdään että ison HDL:n potentiaali on minimissään 1,8 mV, ja katkoviivalla merkitty liukupinta osuu lähelle minimiä. Tarkalleen ottaen potentiaali liukupinnan kohdalla, eli zeta-potentiaali, on $-1,6\pm0,4$ mV. Pienen HDL:n zeta-potentiaali on vastaavasti $-0,5\pm0,4$ mV. Kumpikin tulos  on itseisarvoltaan selvästi pienempi kuin aiemmin mainittu kokeellisesti määritetty zeta-potentiaali, joka oli noin $-12$ mV. Potentiaalin keskivirhe on myös yllättävän suuri siihen nähden että laskuihin on käytetty yli mikrosekunnin verran simulaatiodataa. Tarkempi zeta-potentiaalin määritys edellyttäneekin todella pitkiä simulaatioita. Simulaatioista tulisi myös tehdä useampia rinnakkaisia kopioita, jotta voidaan todeta tulosten toistettavuus.
\begin{figure}[t]
  \centering
  \tikzsetnextfilename{varaus}
  \begin{tikzpicture}
    \begin{axis}[
	width=0.65\textwidth,
	xmin=2, xmax=8,
	ymin=-45, ymax=40,
	minor x tick num=1,
	minor y tick num=3,
	restrict x to domain={2:8},
	xlabel={Etäisyys $r$ [nm]},
	ylabel={Varaus [e]},
	legend style={at={(1.05, 1.00)},anchor=north west},
	/pgfplots/table/x index=0,
	/pgfplots/table/y index=1,
      ]
      \errorband{xvg/big/potential/CO_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{orange}{0.4}{solid};
      \errorband{xvg/big/potential/POPC_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{green}{0.4}{solid};
      \errorband{xvg/big/potential/Protein_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{purple}{0.4}{solid};
      \errorband{xvg/big/potential/Water_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{cyan}{0.4}{solid};
      \errorband{xvg/big/potential/NA_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{red}{0.4}{solid};
      \errorband{xvg/big/potential/CL_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{blue}{0.4}{solid};
      \errorband{xvg/small/potential/CO_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{orange}{0.4}{dashed};
      \errorband{xvg/small/potential/POPC_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{green}{0.4}{dashed};
      \errorband{xvg/small/potential/Protein_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{purple}{0.4}{dashed};
      \errorband{xvg/small/potential/Water_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{cyan}{0.4}{dashed};
      \errorband{xvg/small/potential/NA_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{red}{0.4}{dashed};
      \errorband{xvg/small/potential/CL_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{blue}{0.4}{dashed};
      \addlegendentry{CO}
      \addlegendentry{POPC}
      \addlegendentry{Proteiini}
      \addlegendentry{Vesi}
      \addlegendentry{Na$^{+}$}
      \addlegendentry{Cl$^{-}$}
    \end{axis}
  \end{tikzpicture}
  \caption{Systeemin komponenttien kumulatiivinen varaus etäisyydellä $r$ HDL:n massakeskipisteestä. Yhtenäiset viivat kuvaavat isoa HDL:ää ja katkoviivat kuvaavat pientä HDL:ää.}
  \label{fig:varaus}
\end{figure}

Systeemien zeta-potentiaalien eron syyn selvittämiseksi voidaan tarkastella miten systeemin eri komponentit vaikuttavat potentiaaliin. Kuvassa \ref{fig:varaus} on esitetty systeemin kunkin eri komponentin kumulatiivinen varaus. Fosfolipidien polaariset pääryhmät aiheuttavat negatiivisen varauksen hiukkasen pinnan kohdalle. Vesimolekyylit orientoituvat lipidipääryhmien läheisyydessä siten, että ne neutraloivat lipidien varauksen suurimmaksi osaksi. Vesimolekyylit ovat jonkin verran orientoituneita vielä melko kaukana HDL:n pinnasta, sillä vielä 7 nm etäisyydellä HDL:n keskipisteestä on havaittavissa veden aiheuttamaa positiivista varausta. ApoaA-I -proteiinilla on negatiivinen kokonaisvaraus, mutta hiukkasen pinnan läheisyydessä apoA-I:n aiheuttama kumulatiivinen varaus on hieman positiivinen. Natrium-ionit ovat keskimäärin hieman lähempänä hiukkasen pintaa kuin kloori-ionit, joten ionien kokonaisvaikutus varaukseen hiukkasen pinnalla on positiivinen. 
Hydrofobinen kolesteryylioleaatti ei juurikaan vaikuta systeemin varaukseen.

Pienessä systeemissä kaikkien komponenttien vaikutus näkyy luonnollisesti hieman lähempänä HDL:n keskipistettä, mutta natrium-ionit näyttäisivät olevan muihin komponentteihin verrattuna lähempänä. Tämä saattaa olla selitys pienen ja ison HDL:n zeta-potentiaalien erolle. Visuaalisessa tarkastelussa havaittiin yli nanosekunnin kestäviä kontakteja natrium-ionien ja HDL:n välillä, joten mahdollisesti pienessä systeemissä tällaisia kontakteja on sattumalta enemmän.
On myös mahdollista että simulaatioissa ionit sitoutuvat epärealistisen voimakkaasti lipideihin, mikä selittäisi miksi kummankin systeemin zeta-potentiaali on paljon positiivisempi kuin sen todellisuudessa pitäisi olla.
Veren suola ei myöskään ole puhdasta natriumkloridia, vaan todellisuudessa veressä on myös kaliumia ja muita positiivisia ioneja, jotka saattavat käyttäytyä eri tavalla kuin natrium.
Aiemmin mainittu kineettisen energian epätasainen jakautuminen saattaa myös edesauttaa natrium-ionien sitoutumista HDL-hiukkasiin. 

Kuvassa \ref{fig:orientaatio} esitetty vesimolekyylien keskimääräinen orientaatio etäisyyden $r$ funktiona vahvistaa kumulatiivisen varauksen perusteella tehdyt päätelmät veden orientoitumisesta. Juuri lipidien pääryhmien kohdalla orientaatiokäyrä saavuttaa miniminsä, eli vesimolekyylien positiivista osittaisvarausta kantavat vetyatomit keskimäärin osoittavat hieman kohti HDL:n keskipistettä. Keskimääräinen orientaatio ei ole montaakaan astetta, mutta vesimolekyylien suuri määrä tekee siitä merkittävän. Kuvassa \ref{fig:orientaatiojakauma} on esitetty vesimolekyylien orientaatiokulmien jakauma lipidipääryhmien kohdalla. On noin kaksinkertainen todennäköisyys, että vesimolekyylin happiatomi osoittaa pois päin HDL-hiukkasesta, kuin että se osoittaisi kohti HDL-hiukkasta.


%\begin{figure}[t]
  %\begin{subfigure}[t]{0.49\textwidth}
    %\centering
    %\tikzsetnextfilename{potentiaali}
    %\begin{tikzpicture}
      %\begin{axis}[
	  %width=7.3cm,
	  %height=6.5cm,
	  %xmin=5.5, xmax=10,
	  %ymin=-2.7, ymax=2.7,
	  %ytick={-4,-3,...,4},
	  %minor x tick num=1,
	  %minor y tick num=4,
	  %xlabel={Etäisyys $r$ [nm]},
	  %ylabel={Potentiaali [mV]},
	  %%legend style={at={(0.95, 0.60)},anchor=north east},
	  %restrict x to domain={5:11}
	%]
	%\errorband{xvg/big/potential/Potential_500001-1600000_100-mean.xvg}{0}{1}{2}{blue}{0.4}{solid};
	%\errorband{xvg/small/potential/Potential_500001-1600000_100-mean.xvg}{0}{1}{2}{red}{0.4}{solid};
	%\addplot [gray, dashed] coordinates {(6.5,-3) (6.5,3)};
	%\addlegendentry{Iso HDL}
	%\addlegendentry{Pieni HDL}
      %\end{axis}
    %\end{tikzpicture}
    %\caption{Sähköstaattinen potentiaali etäisyydellä $r$ HDL:n massakeskipisteestä.}
    %\label{fig:potentiaali}
  %\end{subfigure}
  %\begin{subfigure}[t]{0.49\textwidth}
    %\centering
    %\tikzsetnextfilename{debyehuckel}
    %\begin{tikzpicture}
      %\begin{axis}[
	  %width=7.3cm,
	  %height=6.5cm,
	  %xmin=5.5, xmax=9,
	  %ymin=0.133, ymax=0.146,
	  %minor x tick num=1,
	  %minor y tick num=1,
	  %ytick={0.13,0.135,0.14,...,0.15},
	  %xlabel={Etäisyys $r$ [nm]},
	  %ylabel={Tiheys [1/nm$^3$]},
	  %%legend style={at={(0.95, 0.60)},anchor=north east},
	  %restrict x to domain={2:10},
	  %y tick label style={/pgf/number format/fixed, /pgf/number format/precision=3},
	%]
	%\addplot [black] table [x index=0, y index=1] {xvg/big/slippingplane/radialdensity_NA.xvg};
	%\addplot [red] table [x index=0, y index=1] {xvg/big/slippingplane/debyehuckel.xvg};
	%\addplot [gray, dashed] coordinates {(6.5,0) (6.5,1)};
	%\addlegendentry{tiheys}
	%\addlegendentry{DH}
      %\end{axis}
    %\end{tikzpicture}
    %\caption{Debye-Hückel -käyrä (DH) sovitettuna natrium-ionien tiheyteen.}
    %\label{fig:debyehuckel}
  %\end{subfigure}
  %\caption{Zeta-potentiaalin määritys sähköstaattiesesta potentiaalista. Ison HDL:n arvioitu liukupinnan sijainti 6,5 nm on merkitty kuviin harmaalla katkoviivalla.}
  %\label{fig:zeta}
%\end{figure}




\begin{figure}[t]
  \begin{subfigure}[t]{0.49\textwidth}
    \centering
    \tikzsetnextfilename{orientaatio}
    \begin{tikzpicture}
      \begin{axis}[
	  width=7.2cm,
	  height=7.0cm,
	  xmin=3, xmax=6,
	  ymin=-0.15, ymax=0.22,
	  minor x tick num=1,
	  xlabel={Etäisyys $r$ [nm]},
	  ylabel={$\cos(\theta)$},
	  %legend style={at={(0.95, 0.60)},anchor=north east},
	  y filter/.expression={y==0 ? nan : y},
	]
	\errorband{xvg/big/sorient/sord_column1_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{blue}{0.4}{solid};
	\errorband{xvg/small/sorient/sord_column1_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{red}{0.4}{solid};
	\addplot [blue, dashed] coordinates {(4.44,-3) (4.44,3)};
	\addplot [red, dashed] coordinates {(4.32,-3) (4.32,3)};
	\addlegendentry{Iso HDL}
	\addlegendentry{Pieni HDL}
      \end{axis}
    \end{tikzpicture}
    \caption{Vesimolekyylien orientaatio etäisyydellä $r$ HDL:n massakeskipisteestä.}
    \label{fig:orientaatio}
  \end{subfigure}
  \begin{subfigure}[t]{0.49\textwidth}
    \centering
    \tikzsetnextfilename{orientaatiojakauma}
    \begin{tikzpicture}
      \begin{axis}[
	  width=7.2cm,
	  height=7.0cm,
	  xmin=-1, xmax=1,
	  %ymin=0, ymax=120,
	  %minor x tick num=1,
	  xlabel={$\cos(\theta)$},
	  ylabel={suhteellinen todennäköisyys},
	  %legend pos = south west,
	  %legend style={at={(0.95, 0.60)},anchor=north east},
	  y filter/.expression={y==0 ? nan : y},
	]
	\errorband{xvg/big/sorient/sori_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{blue}{0.4}{solid};
	\errorband{xvg/small/sorient/sori_500001-1600000.xvg}{0}{1}{2}{red}{0.4}{solid};
	\addlegendentry{Iso HDL}
	\addlegendentry{Pieni HDL}
      \end{axis}
    \end{tikzpicture}
    \caption{Vesimolekyylien orientaatiojakauma fosfolipidien pääryhmän kohdalla.}
    \label{fig:orientaatiojakauma}
  \end{subfigure}
  \caption{Vesimolekyylien keskimääräinen orientaatio HDL:n läheisyydessä. Kulma $\theta$ on HDL:n pinnan normaalin ja vesimolekyylin happiatomista vetyatomien keskipisteeseen kulkevan vektorin välinen kulma. Vesimolekyylin happiatomin osoittaessa kohti HDL-hiukkasta $\cos(\theta)$ on positiivinen ja happiatomin osoittaessa pois päin HDL-hiukkasesta $\cos(\theta)$ on negatiivinen. Kaukana HDL:n pinnasta $\cos(\theta)$ lähestyy nollaa, eli orientaatio katoaa. Katkoviivat osoittavat fosfolipidien pääryhmän keskimääräisen sijainnin.}
\end{figure}



%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%%% YHTEENVETO %%%
%%%%%%%%%%%%%%%%%%
\chapter{Yhteenveto}

Kahden simuloidun  HDL-hiukkasen ominaisuuksien todettiin vastaavan melko hyvin kokeellisia tuloksia. Mitatut suureet sopivat hyvin yhteen myös muiden molekyylidynamiikkasimulaatiotutkimusten kanssa. Simulaatioissa kuitenkin oli muutama ongelma, joiden takia tuloksista tehtävien johtopäätöksien kanssa täytyy olla varovainen. Ensimmäinen ongelma  on apoA-I -proteiinien sekundaarirakenteen purkautuminen, joka laski hiukkasten alfa-heliksisyyden epäluonnolliselle tasolle. Toinen ongelma oli termostaattialgoritmin huolimattomasta käytöstä johtuva kineettisen energian epätasainen jakautuminen systeemeissä, mikä johti käytännössä HDL-hiukkasten viilentymiseen ja mahdollisesti sitä kautta jähmettymiseen. Tämän epäillään vaikuttavan oleellisesti kaikkiin tuloksiin, etenkin sähköstaattiseen potentiaaliin. Ongelmista huolimatta tässä työssä esiteltyä HDL-hiukkasmallia on hyödynnetty jo julkaistuissa tutkimuksissa \cite{karilainen2015oxidation}.

HDL-hiukkasten zeta-potentiaaleiksi määritettiin $-1,6\pm0,4$ mV (isompi hiukkanen) ja  $-0.5\pm0.4$ mV (pienempi hiukkanen). Aggregoitumisen kannalta oleellista on, että määritetyt arvot ovat negatiivisa kuten kokeellisesissa tutkimuksissa on todettu. Määritetytyt arvot ovat silti melko kaukana kokeellisesti määritetystä noin $-12$ millivoltista. Eron syyn selvittäminen edellyttää jatkotutkimuksia, jotka ovat jo käynnissä. Jatkotutkimuksissa edellä mainitut simulaatioiden ongelmat on selvitetty, ja lisäksi tutkitaan mikä on  monimutkaisemman lipidikoostumuksen vaikutus.

%%%%%%%%%%%%%%%
%%% Lähteet %%%
%%%%%%%%%%%%%%%
%\nocite{koivuniemi_revealing_2012}
\renewcommand{\bibname}{Lähteet}
\bibliographystyle{abbrv}
\bibliography{lahteet}



\end{document}
